微生物组样本测序深度不等，稀释与非稀释分析怎样交代？

先说明深度差异有多大

微生物组样本常得到不同数量的有效读段。测序较浅的样本更不容易检出低丰度分类单元，因此直接比较观察到的丰富度会混入采样努力差异。投稿时先给出每个样本过滤后的读段数、分布范围、低质量样本排除标准以及分析对象。若对照组普遍比病例组浅，要明确这种不平衡；只报告平均深度会把尾部的低深度样本藏起来。

抽平读段能换来什么、又丢掉什么

所谓稀释或抽平，是从较深样本随机抽取相同数量的读段。它可为某些多样性比较提供共同的采样深度，却会丢掉原本测得的序列，浅于门槛的样本甚至会被排除。方法段应写抽样深度、随机种子、重复次数以及每组失去多少样本。门槛若由结果显著性反复挑选，读者无法判断最终差异是否稳定。不要只写“数据标准化后分析”，因为不同处理方法回答的统计问题不同。

非稀释方法也要说明模型

差异丰度分析通常可使用考虑库大小或组成特性的模型，并非所有问题都需要先抽平。关于稀释的原始方法文献指出，作为差异丰度检验的预处理，丢弃读段可能降低效率；后续研究也讨论不同条件下的取舍。投稿要写清所用模型、归一化方式、零值处理和多重检验，而不是简单宣布某一种方法对所有数据都正确。若使用相对丰度，应提醒它反映的是组成比例，不直接等于绝对微生物负荷。

多样性和差异丰度分开报告

同一研究可以在多样性分析使用固定深度抽样，在差异丰度分析保留原计数并用合适模型；方法必须分别写明。丰富度曲线能帮助判断新增读段是否仍带来很多新分类单元，但曲线趋缓不能证明不存在技术偏差。β多样性分析还应标注距离定义、置换规则和批次因素。若不同指标使用不同样本子集，图例和表格都应给出各自的样本数，不能让读者以为所有结果来自同一批数据。

用敏感性结果解释选择

可选两个事先有意义的深度门槛，比较保留样本数和关键结论；也可用一种非稀释方法作补充分析。若结果只在某个门槛下成立，就把这种依赖性写出来。提交前核对是否保存原始计数、抽样后的矩阵和样本排除表。读者由此能区分生物差异与分析选择带来的差别，而不用猜测那个整齐的柱状图背后丢弃了多少数据。

参考信息：微生物组稀释方法原始论文、方法比较研究与STROBE-metagenomics报告指南。