测序样本单双端读长混用，质控与比对怎样报告？

一批RNA测序样本有些是单端读段，有些是双端读段，读长也不相同，稿件却只写“所有样本按统一流程测序并比对”。这会掩盖可比性问题：单端与双端的读段数量、可定位信息和某些质控指标不能直接用同一口径描述。投稿方法段应按样本和运行批次把条件写明，再说明分析如何处理差异。

先把每个样本对应的测序运行列成清单。列样本编号、文库类型、单端或双端、每端读长、测序平台、运行编号与原始文件数。ENA的RNA测序元数据规范把文库布局和实验条件列为重要字段；其元数据模型又区分实验与运行，便于把文库设计和实际读段文件对应。若某个样本重测后合并两次运行，写清合并前后的记录和理由，别把技术重跑当成独立生物学样本。

质控结果要注明分母。双端测序可报告读对数和两端各自质量，单端只能报告读段数；把两者都写成“reads”容易让双端样本的总量看似翻倍。列出接头去除、低质量截断、最短读长阈值和过滤后保留量。若两种布局使用不同参数，分别说明；若参数相同，也要核对该参数是否适用于两类原始文件。对于短读长批次，过严的截断可能使可比对比例下降。

比对工具或流程应说明单端文件与成对文件各自如何传入，是否允许孤儿读段、如何处理多重比对和重复片段。报告唯一比对率时注明按读段还是按读对计算。若下游只使用共同可定义的指标，可解释选择理由；若对剪接异构体等需要成对信息的任务进行比较，分析应承认信息量差异。不能把单端样本的缺失配对信息用一个平均比对率掩盖。

检查测序布局与研究组别是否混杂。例如病例几乎全是单端、对照几乎全是双端，批次差异可能被误读为生物学差异。方法段说明批次校正、共同过滤标准或分层分析，以及剩余局限。结果表中给出每组按布局分类的样本数；质量分布明显不同的样本要说明剔除规则和时间点，不能因结果方向而临时挑选。

投稿前从原始运行编号抽查一例单端和一例双端，复现文件数、读长、质控和比对摘要。将软件版本、参考基因组、参数与样本清单作为补充材料或可访问记录。读者不必看到受限原始数据，也应能判断每个结果来自哪类测序条件。

若需要把不同读长的样本共同纳入表达量比较，应说明计数单位、归一化方法与读长相关偏差的检查。对只在一种文库布局中可靠估计的指标，可单独分析而不是勉强合并。提供分组后的质控图，有助于审稿人看到批次问题是否集中在某一研究组。

参考信息：欧洲核苷酸档案库RNA测序与元数据官方文档。