RNA-seq链特异性文库，方法段应写哪些信息？

RNA测序稿件的方法段写了“采用链特异性文库”，却没说明这种特性怎样在定量软件中使用。读者可能知道建库试剂盒名称，仍无法判断哪一端读段对应转录本方向，也无法复核反义转录本的计数。ENCODE的批量RNA测序标准明确区分链特异性与非链特异性文库，并在处理结果中分别保留正负链信号。投稿前要把实验建库与下游计数使用的链方向接起来，而不是把“链特异性”当作一句装饰性描述。

从样本到文库，说明链信息如何保留

先写清样本类型、RNA提取与质量检查、富集或去除方案、建库方案及试剂盒版本，必要时注明偏离标准流程的步骤。这里还要写单端还是双端测序、读长，以及每个生物样本对应哪个文库。链特异性通常由具体建库化学过程形成；不同方案的方向约定可能不同，不能看到试剂盒名称就凭记忆填写软件参数。若研究中混用了不同建库批次，给每批标明方案，并说明是否采用同一方向口径。

接着说明如何判定读段与转录本正负链的关系。应先依据建库协议和试剂说明确定预期方向，再在已知注释区域用合适工具检查读段方向比例；若两者不符，回到原始记录排查，不能按结果外观随意选参数。单端与双端文库的判定方式不同，软件选项里的正链、反链或无链模式也未必使用相同命名。在文中并列记录协议、检查结果和软件参数，并写明参数对应的方向定义。

计数和展示要沿用同一方向口径

比对或准比对、基因计数与转录本定量时，注明软件及版本、参考注释版本、链方向设置和是否允许多重比对。若某一步使用无链模式，不能仍把最终正负链表达解释为链特异性结果。尤其在重叠基因、反义转录本或长非编码RNA研究中，方向设置会改变读段归属；即使总体比对率看似正常，也不能证明方向参数正确。按样本列出采用的参数，至少抽查方向敏感的已知位点与预期是否一致。

展示覆盖度轨道或导出可视化文件时，说明正负链轨道是分别生成还是合并生成，并让图注与分析设置一致。ENCODE的处理说明对链特异性数据分别提供正负链信号，而非链特异性数据不按链区分；这说明轨道的含义依赖文库属性和处理方式。若图中把两条轨道着成不同颜色，却没有交代其生成规则，读者无法判断一条峰究竟来自哪一链。对于无链文库，不要通过绘图选项制造看似有方向的证据。

提交前用一张小表串起“样本编号—文库方案—单双端—方向验证—定量参数—结果文件”。再检查方法、补充材料和数据仓库元数据是否使用同一组描述。欧洲核苷酸档案馆把样本、实验与测序运行分别关联，公开记录中的文库布局等字段也可用于复核；但仓库登记不能替代论文解释方向判定。若方向记录已遗失，需说明可确认的信息及分析限制，不能以“采用标准流程”掩盖关键参数。

参考信息：ENCODE批量RNA测序数据标准及处理流程；欧洲核苷酸档案馆数据模型与测序记录说明。