测序批次与实验组混在一起，RNA-seq稿件怎样揭示？

先把样本排布写出来

当全部对照样本在第一天建库、全部处理样本在第二天建库，表达差异可能混合了处理与建库时间的作用。稿件不能只写“已进行批次校正”便跳过这层设计事实；建库日期与测序上机日期若不同，也应分列。先做一张样本元数据表：样本编号、供体或生物重复、处理组、取样日期、RNA提取、建库批次、测序批次和排除情况各占一列。正文用一句话说明哪些因素与组别交叉，哪些完全重合，读者才知道模型能识别什么。

交叉设计与完全重合不一样

若每个批次里都有处理和对照，批次与组别可以在适当模型中分别表示。DESeq2原始说明展示了把批次项纳入设计式的情形，但是否可估计仍取决于样本分布。若第一批全是对照、第二批全是处理，两个变量完全重合，单凭这些样本不能可靠估出独立的处理效应。此时即使画出漂亮的校正后主成分图，也不能声称问题已被消除。应如实缩小结论，必要时追加跨批次的样本或独立验证。

先把两种颜色的图都摆出来

可同时展示按组别和按批次着色的探索图，并注明图使用的是原始计数变换值还是用于展示的调整值。主要差异分析应说明输入矩阵、设计式、对比、样本数和过滤规则。若为了可视化另做批次调整，不能把调整后的矩阵误称为原始计数，也不能未经核对就替代差异模型的输入。遇到离群样本，需交代判定标准是在看见组间差异之前还是之后确定。

敏感性分析能回答什么

对于部分混杂而非完全重合的设计，可报告加入批次项前后的效应方向和不确定性，或在样本足够时做批次内比较。若批次内根本没有可比组，所谓批次内敏感性分析就无法实施。观察到结果稳定也不等于不存在批次影响，只能说明在指定处理方法下结论未明显改变。若额外实验跨批次复现，应把它与原始测序分析区分呈现，别悄悄并成同一套生物重复。

投稿陈述要匹配证据

方法段说明真实操作顺序，结果段报告批次与组别的分布，讨论段说明剩余不确定性。比如“六个处理样本全部由第二批建库”比“已控制潜在技术偏差”更有信息量。编辑和读者据此能判断哪些结论来自数据本身，哪些需要后续验证。批次记录不是给分析找借口，而是防止把无法分离的两种来源写成一个确定的生物机制。

参考信息：DESeq2官方分析说明与单细胞批次设计原始研究。