RNA-seq生物学重复与技术重复，样本数怎样分开？

RNA-seq稿件写“每组测序六个样本”，原始记录却显示只有三名受试者，每人的同一份RNA各建了两个文库。六个文库不等于六个独立生物学重复；若按六名受试者估计组间变异，差异表达结果可能过于乐观。投稿前应把受试者、采样组织、RNA提取物、文库和测序运行逐层对应，分别报告独立生物单位数和技术重复数。

先定义真正独立的生物单位

在人群研究中可能是一名受试者，在独立培养实验中可能是一次单独培养；具体单位由研究设计决定。同一受试者的两块组织、同一样本的两次提取或同一文库的两个测序泳道，分别对应不同层级，不能统称“两个独立样本”。方法段列出每组受试者或独立培养数、每单位取样次数、提取次数与建库次数，并说明配对或重复测量关系。ENCODE的文件格式规范也将独立生物重复与同一样本的不同文库或测序泳道区分。

做一张从样本到文件的映射表

为每个独立单位赋予固定ID，再记录组织或时间点ID、RNA提取ID、文库ID和FASTQ文件名。若同一文库分两个泳道测序，可在核对文库身份与质控后按预定流程合并读段，并保留文件对应关系。若同一RNA提取物建两次库，可以用于估计技术稳定性，是否合并或用分层方法处理应预先说明。不能为追求更大的n而让技术重复在差异表达模型中冒充互不相关的生物单位。

让统计模型对应设计层级

差异表达分析通常关心独立生物单位之间的差异，因此结果表中的n要与设计单位一致。若同一人有治疗前后样本，应记录配对关系并在适用模型中处理；若同一人多个组织样本，也要考虑其相关性。生物重复很少时，加深测序或增加同一文库的泳道不能补出新的独立个体。原始RNA-seq实验设计研究显示，在一定条件下增加生物学重复可比单纯增加读数深度更有助于差异表达分析；具体取舍仍取决于问题、成本和测序质量。

质控结果分层展示

可分别报告各文库的读段数、比对率和RNA质量，再报告生物重复之间的表达一致性及异常样本处理。技术重复的高相关只能说明这一层测量稳定，不能证明受试者之间变异很小。若删除某个文库或合并多个泳道，说明预设质控阈值、原因和影响到哪个生物单位。提交公共数据时，元数据中的受试者、样本、文库和文件关系也应与论文一致，避免一份文库被标成两名供体。

例如每组有三名受试者，每人一份RNA、两次建库，共六个文库。方法应写“每组三个生物学重复、每个RNA样本两个技术建库重复”，并给出六个文库如何汇总到三名受试者的表达量。定稿时从差异表达设计矩阵抽查一行，确认其样本ID与映射表对应；若模型把六个文库直接当独立n=6，应按原设计重核效应估计、区间和结论。

参考信息：ENCODE文件格式与重复定义规范；《RNA-seq差异表达研究：增加读数还是增加重复？》。