测序读段修剪阈值和保留数，RNA-seq方法怎样报告？

RNA-seq方法段常见一句“原始读段经质量控制后用于比对”，却没有说删了什么、留下多少。读者因此无法判断接头序列是否清除、双端读段是否仍成对，也无法解释样本间读段数差异。修剪并非越严格越可靠：原始比较研究发现，过度修剪可能改变表达估计；另有基准研究显示，在特定数据和定量任务中不修剪也可得到可比结果。投稿稿件应报告实际处理规则和处理前后的证据，而不是把某个阈值写成通用标准。

先列出每个样本的起点

记录测序平台、读长、单端或双端、原始FASTQ文件数量及样本对应关系。双端数据要明确计数单位是read pair还是单条read，避免把两个文件的读段数相加后误称为成对数。若一个样本跨多个lane测序，说明先分别质控还是先合并，再列出每个lane和合并后的数量。原始数据质量不一致时，平均数会掩盖少数异常样本，最好保留逐样本表和质控图。

写出被执行的修剪与过滤动作

列明软件和版本、接头识别方式、碱基质量阈值、滑窗或末端剪切规则、最短保留长度，以及含不确定碱基读段的处理方式。若软件有自动识别接头或处理特定平台尾部伪影的功能，写清是否启用，不要仅用“默认参数”替代可复现设置。质量分数阈值须说明作用于单个碱基、一个窗口，还是整条读段。对带UMI的文库，还应交代UMI提取与修剪的先后，避免把UMI序列误当转录本序列处理。fastp原始论文说明同一工具可同时执行多种过滤动作，故工具名本身不足以推断实际处理内容。

前后数量要能对账

在补充表逐样本列出原始读段或读对数、接头修剪数、质量或长度过滤数、最终保留数及比例；各类别可能重叠，不能未经定义就直接相加。双端数据说明一端不合格时另一端如何处理，后续比对输入的是完整读对还是含单端残留。再报告比对或定量阶段的输入数、唯一比对数和后续用于表达分析的数目，并说明这些数目在哪一阶段产生。若文中给出百分比，分母应紧挨指标写清，不让“保留率”在原始读段和过滤后读段之间切换。

用下游结果检查规则是否合适

比较修剪前后的长度分布、接头污染、低质量尾部、比对或定量指标。若某个样本损失远高于其他样本，先检查文库质量、平台特征、样本标签与参数日志，再决定是否排除；不宜为了把保留率调高而临时放宽规则。对关键差异表达结论，可在可行时做一项参数敏感性检查，并记录变化。数据特点不同，合适的处理规则可能变化；论文应解释本次规则的理由与影响边界。

投稿前随机抽一份FASTQ，从原始文件、质控报告、命令参数、处理后文件走到比对结果，核对样本编号与读段单位。这样既能发现成对数和单条数混用，也能让“质量控制后用于分析”变成真正可复查的步骤。

参考信息：fastp原始方法论文；RNA-seq读段修剪对表达估计影响的原始研究；RNA-seq不修剪定量基准研究。